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溃疡性结肠炎患者及其配偶的肠道菌群构成与多

溃疡性结肠炎(UC)主要是以累及直肠和结肠的慢性非特异性炎症性肠病。研究表明,UC在欧洲的发病率已达0.97~57.9/10万人,亚洲和中东近几年发病率快速上升,达0.15~6.5/10万人[1-2]。目前认为UC是免疫、遗传、环境及肠道菌群等多因素共同作用的结果。研究表明,某些肠道菌群释放大量毒素损伤黏膜,诱导细胞死亡并刺激细胞炎症因子释放,引起肠道黏膜炎症反应[3-4]。此外,外界环境同样是引起UC发病的因素之一[5]。本文比较UC患者与其同一生活环境下患者家属,以及与正常体检人群肠道菌群的差异性,探讨生活环境与肠道菌群环境间的相关性在UC发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月至7月浙江中医药大学附属第二医院UC患者8例(UC组)及其配偶8例(UF组),同时招募本院体检健康者8例(ZC组)。本项目经本院医学伦理委员会批准。(1)纳入标准:①年龄18~60岁,性别不限;②根据患者临床表现、肠镜及病理结果,参照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年)》[6]的UC诊断标准,由消化内科及病理科医师共同确诊为UC。③UC配偶组需与UC患者共同生活至少5年、无全身系统性疾病且肠镜检查正常;④健康人群组需与UC患者无血缘关系且不在同一家庭环境下生活;⑤健康人群组无全身系统性疾病且肠镜检查未见肠道病变;⑥所有入选者均签署知情同意书。(2)排除标准:①重度或急性暴发型UC患者;②近2个月内使用抗生素、益生菌制剂及清洁灌肠者;③既往有消化道疾病手术史;④妊娠及哺乳期女性、儿童及精神病患者;⑤患有严重心、脑、肺、肝、肾疾病或高血压、心脏病、糖尿病等慢性疾病。

1.2 方法 (1)粪便样本采集:采集所有入选者自然排出的新鲜粪便(>2 g),迅速将粪便装于无菌样品管中,样品管冰浴1 h内运送至中心实验室无菌条件下进行分装,液氮冷却后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。(2)样本DNA提取、基因组PCR扩增及16S rRNA测序:应用QIAamp DNA Stool Extraction Kit试剂盒从粪便样本中提取肠道微生物基因组DNA后,使用引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')[7]对细菌16S rRNA基因的V3-4可变区进行PCR扩增[7]。扩增条件为95℃解链3 min,95℃30 s,55℃,30 s,72℃45 s,25个循环,72 ℃延伸5 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行质检并纯化。利用Nextera XT Index Kit中的引物在待测DNA的两端接入adaptor序列,用于后续MiSeq上机测序。(3)测序数据分析:剔除原始序列中不含引物、长度在300~480 bp以外、质量评分≤20、含有模糊碱基N及嵌合体的序列,得到最终用于分析的优质序列。将相似度在97%的优质序列聚类为一个操作分类单元(OTU),并用SILVA数据库进行生物学鉴定。最终得到所有OTU表,采用Qiime 软件进行多样性指数分析、主成分分析及菌落组成分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以(±s)表示,多组间比较用方差分析,多重比较采用LSD-t检验;方差不齐时,采用Kruskal-wallis H检验。计数资料组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组基线资料比较 见表1。

表1 三组基线资料比较(±s)组别 n 年龄(岁) 男/女(n) BMI(kg/m2)ZC组 8 36. 4/4 20. UC组 8 43. 4/4 21. UF组 8 41. 4/4 21.

2.2 肠道菌群物种多样性分析 物种多样性分析采用Alpha多样性指标,Alpha多样性是反映丰富度和均匀度的综合指标。丰富度即种类数目;多样性即群落中个体分配上的均匀性。本研究中群落丰富度的指数以Chao1指数表示。群落多样性的指数以Shannon指数表示。(1)Chao1指数:每条曲线代表一个样本,末端数字为实际测序条数。Chao1指数越大,表明群落的丰富度越高。测序序列从15,000起曲线趋于平坦,表明此时测序已趋于饱和,测序数据量合理。三组间Chao1指数差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。(2)Shannon指数:每条曲线代表一个样本,末端数字为实际测序条数。Shannon指数值越高,表明群落的多样性越高。测序序列曲线较早趋于平坦,表明此时测序已趋于饱和,测序数据量合理。三组间Shannon指数差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 Chao1指数曲线注:横坐标表示从样品中随机抽取的序列数,纵坐标表示抽取后分析得到的理论数目,3种颜色的线条表示三组样本

图2 Shannon指数曲线注:横坐标表示从样品中随机抽取的序列数,纵坐标表示抽取后分析得到的理论数目,3种颜色的线条表示三组样本